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益生菌的功效及益生菌活性的研究与分析探索

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益生菌的功效活性研究与分析

引言:
  
  在现代社会中,不健康的饮食结构和作息习惯给人们的身体健康,尤其是肠道健康带来了巨大的隐患。而肠道健康与人体的其他方面健康息息相关,被认为是“万病之源”。因此,身体健康应从肠道健康开始。
  
  益生菌是肠道健康中起重要作用的微生物,本文将以益生菌为对象,在归纳总结其定义、分类、健康功效及其作用机理的基础上,重要就益生菌制品的活性指标,影响其活性的因素,以及目前对提高益生菌活菌数的相关研究进展进行归纳介绍。
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1、益生菌及其功效

  1.1 益生菌的定义
  
  益生菌(Probiotics)是利用动物体内正常的有益微生物,通过鉴定、筛选、培养及干燥等系列工艺制成的活菌制剂。其定义有很多,其中较为广泛承认的是Fuller(1989)的定义,即:益生菌是能改善肠道菌群平衡从而有益于宿主健康的额外补充的活性微生物[1]。而联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)在2001年将益生菌定义为:通过摄取适当的量、对食用者的身体健康能发挥有效作用的活菌[2]。可见,益生菌是对人体具有健康促进作用,可作为功能性食品配料的活性微生物制品。
  
  作为益生菌应具备以下条件:
1)对宿主有益。
2)无毒性作用,无致病作用。
3)能在动物消化道存活。
4)能适应胃酸和胆盐。
5)能在消化道表面定植。
6)能产生有用的酶类和代谢物。
7)在加工和贮存过程中能保持活性。
8)具有良好的感官特性 [3]。
  
  1.2 益生菌的分类
  
  益生菌主要来源于动物肠道内正常生理性菌和非肠道菌。目前,常用的益生菌菌种有:双歧杆菌、乳酸菌和某些链球菌。其中,双歧杆菌主要有青春双歧杆菌、短双歧杆菌、两岐双歧杆菌、婴儿双歧杆菌等;乳酸杆菌主要有嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、胚芽乳杆菌、短乳杆菌、纤维二糖乳杆菌和乳酸乳杆菌等。链球菌主要有粪链球菌、乳链球菌、嗜热唾液链球菌和乙酸乳酸双链球菌。此外,明串球菌属、足球菌属、丙酸杆菌属和芽孢杆菌属的菌种也可作为益生菌[4]。
  
  1.3 益生菌的健康功效及其作用机理
  
  益生菌被广为认可的健康功效包括促进乳糖消化、对肠道致病菌起拮抗作用等。研究表明,益生菌对乳糖不耐症的减缓和抗腹泻效果非常明显,抗癌和免疫调节效果比较乐观,但尚需更多临床实验证明[5]~[8]。益生菌的健康功效及可能的作用机理归纳见表1:
 
表1 益生菌已被临床证实或尚未完全证实的保健功能:
 

保健作用

推测的作用机理

促进乳糖消化

通过菌体产生的酶水解乳糖

对肠道致病菌的拮抗作用

分泌性免疫作用;

抑制致病菌在消化道内定殖;

改变肠道内环境(pH、短链脂肪酸、细菌素),降低致病菌的活力;

钝化毒素结合位点;

调节肠道菌群组成;

通过在小肠粘膜的吸附,排斥致病菌的吸附;

促进小肠粘膜素的分泌,干扰致病菌对小肠上皮细胞的吸附。

抗肠癌作用

与畸变剂集合;

使致癌物失活;

抑制肠道内能导致致癌物产生的细菌酶的活性;

激活免疫反应;

减少二次胆盐的产生。

抑制小肠细菌过度繁殖

影响过度繁殖后菌群的活性,减少有毒代谢物的产生;

改变小肠内环境,降低繁殖后菌群的活性或改变其组成。

2、保健作用推测的作用机理

免疫调节

增强对感染及肿瘤的非特异性免疫;

增强与抗原相关的特异性免疫反应;

提高分泌型IgA的表达。

减缓过敏反应

阻止抗原在血液内转移。

调节血脂、减少心血管疾病的发生

通过菌体代谢,降低血清胆固醇水平;

通过胆盐水解酶分解胆盐的作用,促进胆盐排出;

抗氧化作用。

抗高血压

通过肽酶的作用,分解牛乳蛋白后产生两种具有抑制血管紧张素—Ⅰ转化酶的三肽;

菌体细胞壁组分具有抑制血管紧张素—Ⅰ转化酶的作用。

抑制泌尿生殖道感染

吸附与尿道和阴道细胞表面,排斥致病菌的吸附;

抑制致病菌繁殖;

产生抗菌物质(H2O2,生物表面活性剂)。

抑制H.pylor引起的感染

产生抑制H.pylori的物质(乳酸等)。

减少肿中毒引发的脑昏迷

抑制产生脲酶的肠道菌。

  鉴于益生菌的多种健康功效,它已在食品领域和医药领域得到了日益广泛的应用。
  
  2 益生菌制品的活性
  
  2.1 益生菌制品的活性指标
  
  目前,益生菌已广泛地应用于食品、保健品、药品等行业中。然而,许多益生菌制品,特别是酸乳和发酵乳中活菌数较低,这直接制约了益生菌制品的功效。由于益生菌在被人体摄取后经过肠胃时会损失一部分的活性菌,为了弥补这个损失,使益生菌产品在被摄入人体后有足够的数量发挥作用,益生菌产品本身必须具有一定浓度的活菌数。而活菌数指标,成为了益生菌制品最为关键的指标之一。
  
  有报道称,产品中益生菌的活菌数必须至少大于106cfu/mL,才能发挥益生作用[10]。许多国家和组织都对益生菌制品中的活菌数作出了明确规定。例如,瑞士和国际乳联标准化委员会规定产品中益生菌的活菌数必须大于106cfu/mL;日本则规定必须保证终产品益生菌的活菌数大于107cfu/mL[11]。
  
  2.2 影响益生菌活性的因素
  
  益生菌从菌种到制成产品,要经历菌种筛选、发酵培养、浓缩加工、储存等多个环节,每个环节不同因素的变化,都会影响到最终益生菌制品的活性[12]:首先,菌种本身的遗传性状对其活性有着重要的作用,尤其是耐酸和耐胆盐的菌株,其存活率将会较高;其次,菌种发酵培养时,培养基合适的营养条件、pH和水活环境,培养过程中合适的温度、湿度等条件、细胞代谢过程中产生的过氧化氢浓度、有机酸浓度,对菌的存活率亦有重要的作用;而在益生菌菌粉制作、储存和使用工艺的各个步骤会给益生菌带来环境压力的变化,比如离心损伤、浓缩时的高盐浓度压力、冷冻时的低温损伤、干燥时的气压压力损伤、再水化过程中的损伤等,都会不同程度地影响益生菌的活性;而在益生菌制品储存的过程中,储存温度、水活含量、氧气浓度、菌粉酸度等也会影响益生菌制品的保藏活性效率。
  
  益生菌制品的活性对其能否达到有效的益生效果起着关键的作用,同时又因为在其制作的多个环节的过程中会产生不同程度的损失,因此要求在益生菌制剂研制过程中,必须利用高密度发酵技术、菌体细胞分离技术、离心和冻存过程的保护技术等技术手段,来增加益生菌的活菌数含量,或者减少制作过程中的活菌数损失。

3、提高益生菌制品活性的研究

  3.1 益生菌的鉴定和筛选
  
  应用分子生物学的方法,可以根据益生菌基因组DNA序列的特异性,将所需要的菌株从复杂的培养物中鉴定和分离出来。结合自然或人工诱变诱导(后生元)等技术,可以不断地筛选出耐酸和耐胆盐的益生菌菌株,从而有助于提高原生菌的生存能力。
  
  帮助鉴定益生菌的分子生物学方法主要包括基因组探针技术和基因组指纹技术(如RFLPs技术、RAPD技术和AFLPs技术)。其中,探针技术主要使用的有16S rRNA探针、全染色体探针、质粒DNA探针等,将探针技术与生物芯片技术结合,能够从复杂微生物环境中快速检出并追踪感兴趣的菌株。而基因组指纹技术则是利用DNA片段长度的多态性,用以区分不同的菌株,帮助分析动态的、多样的微生物菌株[13]。
  
  3.2 益生菌的遗传修饰
  
  利用基因工程技术改良已经过筛选或被证明有临床效果的菌株,对拓宽益生菌的应用范围,增强其益生作用效果,有很大的作用。现有的研究主要从两方面进行探索:
其一可以利用益生菌作为体内生物反应器表达外源基因,从而获取新的有益性状;
其二可以对内源基因进行遗传修饰,敲除有害基因,构建缺陷性菌株,或者改造功能性的内源基因,筛选更为优良的益生菌菌株[13]。
  
  与传统的诱变方法相比,直接对染色体DNA进行定向操作更有可能保持菌株原有的优良性状,同时也更为有效和省时。具有生存优势的菌种,能够更好地抵御外来环境变化对齐活性的影响,降低在益生菌制品生产过程中的活菌数损失。
  
  3.3 益生菌的发酵培养
  
  益生菌发酵培养过程主要受培养基和发酵工艺的影响。
  
  培养基方面,要获得高密度的培养物,需投入几倍于生物量的多元营养成分,以满足菌迅速生长繁殖的需要。但若培养体系中的某些营养成分,如碳源、氮源或无机盐等浓度超过某一临界值时,为抵抗高盐浓度形成的离子梯度,微生物需要维持胞内环境的稳定,而这一过程是耗能的,其结果会直接减弱菌体生长,降低菌体得率。而随着发酵过程的进行,培养基不断被消耗,在进入稳定期后,营养物质的匮乏将成为限制发酵密度的重要因素。
  
  发酵工艺包括温度、氧、pH、渗透压等各种发酵条件的影响[14-15]。温度的变化一方面影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质,另一方面影响发酵液的物理性质,两者皆直接影响细胞的生长和繁殖过程;氧是制约专性厌氧菌生长的关键因素,尤其是对氧比较敏感的双歧杆菌;pH值变化会通过弱酸或弱碱的变化而改变菌体细胞内的pH值,从而影响细菌的代谢反应,进而影响细胞的生物量和基因产物的表达;渗透压的变化,尤其是糖浓度、盐浓度变化引起的渗透压变化,会破坏菌体细胞的水分平衡,影响正常的新陈代谢活动。
  
  目前国内外的研究中,对于发酵培养过程中提高活菌数,主要的思路有:
(1)选择合适的接种量;
(2)采用单因素试验、正交试验等方法,以求优化培养基成分及用量;
(3)运用二步发酵法;
(4)调整发酵工艺中的各影响因素,使益生菌的生长情况最佳。
  
  3.4 益生菌的浓缩工艺
  
  菌体细胞的浓缩分离技术是制备益生菌冻干制剂重要的中间工艺环节。为了方便操作、节省成本,目前最常用的菌体细胞浓缩分离技术是离心分离法浓缩菌体。该法具有操作简便、设备便于清洗、处理量大适合商业化生产等优点[16]。
  
  但在离心过程中,一方面,部分细胞残留在上清液中而得以损失;另一方面,离心力的剪切作用以及间隙操作中与氧气的接触均能对益生菌造成伤害甚至导致菌体死亡。
  
  除了就离心力、离心时间、离心温度和基质pH等离心条件对益生菌损失率和存活率的影响这方面进行研究,确定活菌收得率最高的适宜离心条件外,目前,国内外还普遍在发酵培养基中添加适当的保护剂,离心过程进行适当的保护。比如,采用胶体等大分子物质作为离心保护剂,能将菌体包裹其中,减少菌体与菌体的直接接触,从而缓冲了离心过程中的剪切力作用,起到了保护作用。同时,在离心过程中,离心保护剂还有效地隔离了菌体与氧、酸等的接触,降低了细胞代谢,保持了细胞的活性。另外,其强持水性可使冻干过程中细胞的水份不至于急剧下降,而使细胞蛋白质结构免遭破坏。
  
  3.5 益生菌的干燥工艺
  
  目前,大多数益生菌制剂都首先制成益生菌菌粉,然后再经过一定的配比,或与其他产品(如酸奶、奶粉)搭配形成终产品后最终进入消费领域。因此,在益生菌粉的制作工艺过程中,干燥工艺是必不可少的重要步骤,但同时干燥过程也是益生菌活性细胞损失比较严重的步骤。目前,常用的干燥工艺有冷冻干燥、喷雾干燥、挤压膨化等。
  
  以比较常见的冷冻干燥法为例,其主要步骤为先把物质中的水分,主要是游离水预先进行降温冻结成固态的冰,然后在真空的条件下使物质中的冰晶升华,待冰晶升华后再除去部分吸附水,而物质本身留在冻结时的冰态固架中,因此其干燥后体积不变,疏松多孔,最终得到残水量很少(1%~4%) 的干制品[17]。细胞在冻干过程中主要会受到以下几个方面的损伤[18-19]:细胞内外形成的冰晶在低温时产生的机械应力对菌体产生的“机械损伤”;由于水的冻结使细胞间隙内的液体逐渐浓缩,从而使电解质的浓度显著增加,引起细胞死亡的“溶质损伤”;冻干过程中由于膜脂肪酸的不饱和度、链的长度、链的分支状态或环绕状态的不正常变化引起的细胞膜通透性变化、功能失调的“细胞膜损伤”;冻干过程某些细胞内关键酶活性的变化导致整个细胞代谢紊乱,直至细胞死亡的“细胞代谢调节作用损伤”。
  
  目前国内外的研究中,对于在干燥过程中如何提高活菌数,是益生菌活性研究的热点,主要的思路有:
(1)添加明胶、黄胞胶、乳脂或可溶性淀粉等干燥保护剂;
(2)采用微胶囊或微型益生菌包埋技术,保护菌体在干燥和储存过程中免受极端热或湿环境对其活性影响;
(3)利用超声波降解乳酸菌释放a-半乳糖酶;
(4)添加氨基酸、多肽、蛋白质等营养成分。
  
  3.6 益生菌的保藏和再水化工艺
  
  在益生菌的后期保存中,温度、空气、光照、相对湿度等因素都对益生菌菌粉的存活率起到很大的影响。有研究表明,在真空、低水活、暗处的环境下保存,益生菌的活性能够得到较长时间的保持[20]。
  益生菌经过冷冻、干燥和保藏的过程后,或多或少地会损失部分(往往是大部分)的活细胞。因此,再水化对冷冻干燥的益生菌来说,是得以恢复的关键步骤。再水化溶液的渗透压、pH和营养元素,再水化过程的温度和容量,同样也会显著地影响到益生菌恢复到活性状态[21-22]。

4、未来展望

  纵观全世界近年来益生菌及其益生产品的研发、生产和销售情况,益生菌在人体健康中起到的重要功效越来越受到研究人员和消费者的关注。而面对益生菌原料、益生菌制剂在培养、制作和保藏等过程中易损失活性,导致终产品存活率不高的情况,目前国内外的研究人员开展了大量研究工作,取得了一定的成效。相信随着这一难题的有效解决,益生菌原料及其衍生益生菌产品、益生菌食品会有更广阔的发展前景。
  
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2021-03-10

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