目前新的研究发现：早期生命阶段的肠道菌群与成年后的高血压有相关性。菌体代谢产物后生元成分中的短链脂肪酸（SCFAs）包括丁酸和丙酸等代谢物，本研究旨在确定给予丁酸或丙酸补充物是否可以在高果糖（HF）饮食的孕期大鼠模型中保护后代免受高血压的影响。实验设置雌性斯普拉格·道利大鼠在妊娠和哺乳期间分为①常规饲料（ND）组；②60%高果糖饮食（HF）组；③HF饮食加丁酸（HFB，400 mg/kg/天）组；和④HF饮食加丙酸（HFP，200 mmol/L）组。雄性大鼠后代在12周龄时采样。母代大鼠的高果糖饮食对后代的血压有损害作用，但丁酸或丙酸的补充可以预防这一情况。丁酸和丙酸的补充治疗都能增加成年后代血浆中丙酸、异丁酸和戊酸的浓度。丁酸补充对三甲胺氧化物代谢和一氧化氮参数有更深远的影响。而丙酸治疗主要影响肠道菌群的组成，直接改变了厌氧率、乳酸杆菌属、铁还原菌属和罗斯氏菌属的丰度。我们的结果为：通过使用后生元以调节肠道菌群来预防母代高果糖摄入引发的高血压提供了新的思路，这一发现值得在临床上推广应用。在过去几十年中，全球饮食对果糖的消费量增加，高血压风险随之增加。由于肾脏对果糖特别敏感，先前有研究表明母体高果糖倾向的饮食可能损害肾脏发育，导致后代成年期的高血压隐患。最近，孕期营养干预作为一种避免高血压发展的策略，开始引起学界关注。母体营养影响胎儿肠道菌群的组成，从而影响后代的健康。先前的研究表明，孕期高果糖饮食不仅改变了母鼠肠道菌群的组成和菌群产生的代谢产物，同样也改变了成年后代的肠道菌群组成。此外，一些针对肠道菌群的治疗已被应用于避免母体高果糖饮食引发的发育基因编程。丙酸、丁酸和乙酸等短链脂肪酸是主要的肠道菌群产生的代谢产物。膳食纤维通过肠道菌群发酵产生短链脂肪酸。通过激活它们的受体，短链脂肪酸可以直接调节血压。作为后生元物质之一，短链脂肪酸已经显示出对母体健康和胎儿发育的益处。此外，孕期中的丁酸和丙酸补充物显示了它们对避免母体由不当饮食引发的后代高血压的保护作用以及避免母体慢性肾脏疾病饮食引发的后代高血压的保护作用。我们先前的研究观察到母体高脂饮食引发的高血压也与另一种微生物代谢产物三甲胺（TMA）有关。TMA可以转化为三甲胺氧化物（TMAO），与高血压的发展密切相关。虽然已经显示抑制TMA对高血压有益，但通过调节TMA-TMAO通路来预防母体高果糖饮食引发的后代高血压是否可以通过母体短链脂肪酸补充物进行调节仍有待确定。此外，在各种动物模型中，肾素-血管紧张素系统(RAS)的异常和一氧化氮(NO)的缺乏也预示着高血压的发生，例如母代高果糖饮食模式。本研究的目的是评估孕期补充丁酸或丙酸是否可以通过改变微生物组成、微生物群衍生的代谢物（后生元）和参与调节血压的其他机制来预防母亲高果糖饮食导致的子代高血压。孕期SD大鼠分别在妊娠期和哺乳期期间接受常规饲料（ND，n=3）或60%果糖饮食（n=9）。部分接受果糖饮食的大鼠在妊娠和哺乳期间接受丁酸钠（400 mg/kg/天）或饮水中添加丙酸钠（200 mmol/L）的补充。这里使用的丁酸和丙酸剂量是根据我们先前的大鼠研究采用的。出生时，仔鼠被剔除到8只幼仔。由于雄性比雌性更容易发展高血压，所以下一步实验仅使用雄性后代。雄性后代分为四组（每组3个独立窝，每组8只）：ND组（正常饲料），HF组（60%果糖饮食），HFB组（60%果糖饮食加丁酸补充），以及HFP组（60%果糖饮食加丙酸补充）。幼鼠在三周大时断奶并开始进食正常饲料。使用Kent Scientific Corp.（美国康涅狄格州托灵顿）的CODA tail-cuff系统对清醒的大鼠进行非侵入式血压测量。每只大鼠都被置于约束架中，一周前开始适应该程序。在实际记录之前，大鼠后代在12周后被处置。在处置之前，我们采集了大鼠的粪便样本，并将其保存在冷冻器中的-80℃中，直到提取。两个肾脏被切除并称重。从大鼠身上收集血液并放入肝素管中。血浆样本被分装并存储在冷冻器中的-80℃中。使用HP系列1100高效液相色谱（HPLC）系统（美国安捷伦科技公司，特拉华威尔明顿）测量血浆中的肌酸酐浓度。使用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS，安捷伦科技）进行血浆短链脂肪酸浓度的分析，具体方法如我们之前所述。测定乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸。注射体积为1 µL，分流比为5:1。2-乙基丁酸被用作内标。使用安捷伦6410系列三重四级杆液相色谱-质谱联用（LC-MS）对血浆中TMAO、TMA和DMA（TMAO和TMA的代谢产物）的浓度进行分析。简单地说，使用正离子模式下的多反应监测，通过特征的前体产物离子转变：m/z 46.1→30，m/z 60.1→44.1和m/z 76.1→58.1，监测DMA、TMA和TMAO的浓度。流动相由甲醇（20:80，体积比）与A相（15 mmol/L甲酸铵）和B相（乙腈）组成，流速为0.3-1 mL/min。2.4. 肠道菌群的16S rRNA测序和宏基因组学研究我们从粪便样本中提取微生物DNA。使用16S核糖体RNA基因进行宏基因组分析（BiotoolsCo.，台湾新北市）。使用适用于SMRTbell文库制备的条形码引物扩增细菌全长16S rRNA基因，以进行PacBio测序（美国加利福尼亚州门洛帕克）。使用QIIME2软件包对这些序列进行下游分析。根据引物序列的序列变异体（ASVs）序列，通过QIIME2中的FastTree构建了一棵系统发育树。在α多样性分析中，使用Shannon指数和Faith的系统发育多样性指数（PD指数）。在β多样性分析中，使用相似性分析（ANOSIM）和无权重UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）。此外，还应用了线性判别分析效果大小（LEfSe）方法，以确定不同组之间最具差异丰度的分类单位。从肾皮质组织中提取总RNA，并进行实时定量PCR（qPCR），具体操作步骤如我们之前所述。分析了SCFA感受性G蛋白偶联受体（GPR），包括GPR41、GPR43、GPR109A和olfactory factor 78（Oflr78）。RAS的成分包括肾素、血管紧张素转化酶-1（ACE1）、血管紧张素II型1受体（AT1R）、ACE2、（pro）肾素受体（PRR）和MAS受体（MAS），对它们进行了分析。每个样品进行了两次运行。18S核糖体RNA（R18S）被用作参考基因来规范化qPCR数据。表1提供了用于qPCR的引物序列。为了确定相对基因表达，采用了比较阈值周期（Ct）方法。通过比较目标基因与对照基因的相对表达，使用2−∆∆Ct公式计算折叠变化。表1：引物序列用于实时定量PCR (qPCR)分析
使用高效液相色谱（HPLC）方法测量一氧化氮相关参数，包括底物L-精氨酸及其甲基衍生物，不对称和对称二甲基精氨酸（ADMA和SDMA）。我们使用带有o-酞菁二醛（OPA）/3-巯基丙酸（3MPA）衍生物的荧光检测HPLC来测量L-精氨酸及其甲基化衍生物。同型精氨酸被用作内标。我们计算了L-精氨酸与ADMA的比值来表示一氧化氮的生物有效性。所有数据以均值±均值标准误（SEM）呈现。使用单因素方差分析（ANOVA）进行事后的杜鲁检验，以确定组间差异。统计分析使用SPSS 17.0版本（SPSS Inc.，美国伊利诺伊州芝加哥市）进行。p值<0.05表示统计学上的显著性。没有观察到幼仔的死亡。在12周龄时，与ND组和HFP组的后代相比，HF组和HFB组的雄性后代体重增长更多（表2）。肾重量（KW）的变化趋势与之相似，而HFP组的后代在四个研究组中呈现出最低的KW/BW比率。图1显示，母体高果糖饮食导致8周至12周的收缩压上升。通过围产期丁酸酯或丙酸酯治疗，母体高果糖饮食引起的这些收缩压升高得到了预防。在12周时，舒张压和平均动脉压的变化趋势与之类似（表2）。四组后代中的血浆肌酸酐浓度没有差异。表2. 12周龄男性后代的体重、血压和肌酸酐浓度。
N = 8/组;字母标示组间的差异。统计分析采用单因素方差分析，p<0.05.
图1. 男性后代在3到12周龄时的收缩压。每组n = 8；字母表示组之间的差异。通过单因素方差分析进行统计分析，p < 0.05。
总体而言，这些数据显示母体高果糖饮食导致男性后代的高血压和体重增加。丁酸酯或丙酸酯治疗改善了母体高果糖饮食引起的后代高血压。表3说明围产期丁酸酯和丙酸酯补充对12周龄后代的血浆短链脂肪酸水平的影响。与ND组后代相比，母体高果糖饮食显著降低了HF组后代的丙酸、异丁酸和戊酸的血浆水平。与HF组后代相比，HFB组后代的血液中丙酸、异丁酸、丁酸和戊酸的浓度更高。HFP组后代也呈现类似的趋势，除了HF组和HFP组之间的丁酸水平没有差异。四组后代中的乙酸和异戊酸的血浆浓度没有差异。表3. 12周龄男性后代的血浆短链脂肪酸水平。
每组n = 8；字母表示组之间的差异。通过单因素方差分析进行统计分析，p < 0.05。
图2显示，4组子代肾脏中GPR41、GPR43、GPR109A和Olfr78的表达无差异。图2. 雄性后代在12周龄时的肾脏G蛋白偶
联受体41 (GPR41)、GPR43、GPR109A和嗅觉受体78 (Oflr78)的mRNA表达。
与ND组相比，HF组后代的血浆中TMAO水平较高（图3）。与ND组相比，HF组后代的血浆DMA水平较低。母体丁酸酯补充改善了HFB组后代的TMAO水平，但导致DMA进一步降低。各组之间的血浆TMA浓度没有差异（图3B）。图3. 12周龄雄性后代的血浆浓度：(A) 三甲胺-N-氧化物 (TMAO)，(B) 三甲胺 (TMA)，(C) 二甲胺 (DMA)。字母表示组之间的差异。每组n = 8。通过单因素方差分析进行统计分析，p < 0.05。图4展示了12周龄大鼠后代的微生物α和β多样性。α多样性测量的比较显示，Faith PD指数（图4A）和Shannon指数（图4B）均未显示出差异。如图4C所示，基于加权UniFraq距离矩阵的β多样性通过PCoA图可视化，并定义了四个不同的簇。ANOSIM分析显示几乎所有组之间存在显著差异（p < 0.05），除了HF组和HFB组之间（p = 0.083）。图4. α多样性测量：(A) Faith的系统发育多样性 (PD)指数和(B) Shannon指数。(C) 基于主坐标分析 (PCoA) 的β多样性分析。每个点表示给定样本的微生物群落，点的颜色表示该样本所属的组。每组n = 8。
图5A显示了12周龄大鼠后代的菌群组成的门水平。厚壁菌门和拟杆菌门是这四组中的主要门。这一模式与以前的大鼠研究中观察到的相似。图5B显示了四组中主要的属——Duncaniella、Eubacterium、Kineothrix和Ligilactobacillus。在属水平上，母体丙酸酯处理导致HFP组后代的肠道菌群组成发生改变，Lactobacillus明显增加（图6A）。类似的趋势也观察到了属Macellibacteroides（图6B）。与ND组相比，母体高果糖饮食显著增加了HF组后代中的Anaerovorax属的丰度（图6C）。丙酸酯处理恢复了这种增加，但丁酸酯处理没有。此外，母体丙酸酯处理导致HFP组后代中Rothia属的丰度增加，与ND组和HF组后代相比（图6D）。LEfSe分析确定了HF组和HFB组之间菌群丰度差异最大的分类单元，如图7A所示。特别是，HF组中的Duncaniella属及其所属的家族和门的丰度较高。相比之下，母体丁酸酯处理导致Ligilactobacillus属的比例更高。此外，图7B展示了HF组和HFP组之间差异最大的分类单元的多个层次。HFP组的Ligilactobacillus、Eubacterium和Duncaniella的丰度增加。由于一氧化氮和RAAS参与血压的调节，我们进一步评估了丁酸酯和丙酸酯的保护作用是否与这些机制有关。如观察到的（图8），母体高果糖摄入导致较低的L-精氨酸和较高的ADMA水平。这伴随着HF组后代血浆中L-精氨酸/ADMA比值较低。母体丁酸酯处理改善了血浆ADMA水平和AAR。然而，丙酸酯补充对一氧化氮指标几乎没有影响。图5. 12周龄雄性后代肠道菌群的主要（A）门和（B）属相对丰度。
图6. ND组（橙红色）、HF组（绿色）、HFB组（蓝色）和HFP组（紫色）之间的属（A）Lactobacillus、（B）Macellibacteroides、（C）Anaerovorax和（D）Rothia的比较。每组n = 8。* p < 0.05；**p < 0.01；*** p < 0.005；****p < 0.001。
我们进一步分析了后代肾脏中RAAS相关基因的mRNA表达。如图9所示，四个组之间的肾脏RAAS组分的表达没有差异。图7。线性判别分析效应量(LEfSe)确定了(A) HF和HFB组和(B) HF和HFP组之间差异最大的类群。线性判别分析评分的阈值设为4分。
图8。测定雄性子代12周龄时血浆(A) l -精氨酸、(B)不对称二甲基精氨酸(ADMA)、(C)对称二甲基精氨酸(SDMA)和(D) l -精氨酸/ ADMA比值(AAR)。N = 8/组;这些字母代表了组间的差异。统计分析采用单因素方差分析，p <0.05.
图9。12周龄雄性子代肾素-血管紧张素系统各组分，包括肾素、(原)肾素受体(PRR)、血管紧张素转换酶1 (ACE1)和2 (ACE2)、血管紧张素ⅱ1型受体(AT1R)和血管紧张素(1 - 7)MAS受体(MAS)的肾脏mRNA表达。N = 8/组。
本研究首次证明妊娠和哺乳期间通过补充后生元中的丁酸或丙酸，能够保护成年后代免受母体高果糖消费引起的高血压。我们的研究具体如下新的发现：（1）母体摄入高果糖饮食的后代在12周龄时发展出高血压，而母体丁酸或丙酸的补充预防了这一情况；（2）母体丁酸处理增加了成年后代血浆短链脂肪酸的浓度，尽管后代没有直接摄入丁酸；（3）母体丁酸补充恢复了母体高果糖饮食引起的TMAO的增加，但导致HFB后代的DMA进一步减少；（4）母体丙酸补充改变了肠道菌群组成，直接降低了梭菌纲的丰度，同时增加了乳杆菌、铁还原菌属和罗思氏菌属的丰度；以及（5）丙酸对母体高果糖饮食诱导的后代高血压的有益作用与恢复一氧化氮生物可用性有关。我们评估母体摄入富含果糖的饮食的研究结果与人类实验证据一致，即高果糖摄入与高血压的增加有关。已经提出了一些机制来解释母体高果糖饮食引起的高血压情况，如异常的肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）、增加的氧化应激、一氧化氮缺乏、钠转运蛋白功能障碍、表观遗传调节和营养感应信号紊乱。我们的研究进一步强调了肠道菌群及其代谢产物在发育起源性高血压中的重要性。随着对肠道菌群对高血压调控影响的认识不断增加，调节肠道菌群成为治疗和预防高血压的一种新颖治疗策略。这些以肠道菌群为靶点的治疗方法包括益生菌、益生元、后生元、粪菌移植、细菌代谢产物调节等。到目前为止，益生菌、益生元、后生元和TMAO调节已经显示出对母体高果糖饮食诱导的后代高血压的益处。据我们所知，这是首次证明在妊娠和哺乳期间通过丁酸或丙酸的益生物补充具有保护效果来防止这种模型下的后代高血压。目前，丁酸和丙酸作为潜在的代谢性疾病治疗方法正在进行研究。我们的结果证实了以前的研究结果，即丁酸和丙酸具有扩张血管作用，从而降低了高血压模型中的血压值。母体高果糖饮食引起的高血压可以通过不同方式来预防，其中之一就是丁酸或丙酸的补充。丁酸治疗对母体高果糖饮食诱导的后代高血压的积极影响与增加的短链脂肪酸浓度有关，包括丁酸、异丁酸、丙酸和戊酸。短链脂肪酸以不同方式调节血压，其作用受其受体短链脂肪酸受体的调控。GPR109A和GPR41的激活可以降低血压。相反，它们可以被Olfr78和GPR43对抗，导致血管收缩。由于丁酸和异丁酸对GPR41选择性更高，因此丁酸补充可能会产生扩血管作用。值得注意的是，我们的研究结果显示，丁酸补充还影响了另一种微生物代谢产物TMAO。TMAO与高血压风险呈剂量相关关系。血浆TMAO及其代谢物DMA的减少可能归因于肠道微生物TMA生成的减少。丁酸补充对高血压的有益影响，至少部分与调节TMAO代谢有关。丁酸的另一个保护作用可能涉及其增加一氧化氮的生物可用性的能力。一氧化氮缺乏是发育起源性高血压的重要机制。我们当前的研究发现，丁酸补充减少了ADMA（一种NOS抑制剂）的水平，同时增加了AAR（一种衡量一氧化氮生物可用性的指标）。考虑到一氧化氮具有扩血管作用，我们的数据与以前的研究一致，即丁酸可以增强一氧化氮的产生，并在这个模型中保护后代免患高血压。根据我们的数据，丙酸补充增加了乳酸菌、Macellibacteroides和Rothia的丰度，但降低了Anaerovorax的丰度。迄今为止，它们与发育性高血压编程的关系知之甚少，尤其是在母体高果糖饮食模型中。乳酸菌被认为是具有益生菌特性的有益细菌。考虑到以前的研究显示乳酸菌对高血压的益处，我们的结果并不令人意外。一项早期研究报告称，Macellibacteroides属的高丰度与人体正常血压相关。另一项研究揭示了Rothia与高血压呈负相关，而Anaerovorax则在高血压表型中更多地出现。支持以往研究显示特定类群与高血压的发展有关，丙酸补充降低了血压，并与改变的肠道菌群组成相一致，增强或减少了特定菌群。因此，进一步研究还需要确定丙酸治疗是否直接与这些特定菌群的变化相关，以保护后代免受母体高果糖饮食诱导的高血压。与丁酸类似，丙酸补充增加了丙酸、异丁酸和戊酸的血浆浓度。与以前的研究一致，显示这些短链脂肪酸具有降压效果，我们的研究进一步证明了早期补充特定短链脂肪酸可以扭转不良编程进程，并对程序化高血压产生益处。与以前的研究一致，我们的研究发现，母体果糖摄入导致成年后代体重增加。先前的动物研究表明，短链脂肪酸的治疗可以减少或逆转体重增加。一项早期研究显示，口服丙酸可以预防超重成年人体重增加。与这一观察一致，我们发现丙酸补充改善了母体高果糖饮食诱导的后代体重增加。然而，尽管口服丁酸导致肥胖小鼠体重下降，但我们的当前研究未检测到丁酸治疗对后代体重增加的影响。丁酸在已建立的肥胖模型中直接调节体重的机制可能与发育编程模型中的机制不同。由于每种短链脂肪酸的保护作用可能不同，需要进一步研究来探索它们在未来作为高果糖饮食相关疾病的后生元临床应用中的差异。这项研究存在一些限制。首先，这是一项仅限于雄性的研究，因为雄性比雌性更早出现高血压。确定性别差异是否与丁酸或丙酸治疗的反应相关还需要进一步澄清。另一个限制是我们主要关注肾脏。丁酸和丙酸在母体高果糖饮食引起的成年后代高血压中的保护作用可能归因于其他受血压控制的器官系统。第三，我们没有检测其他微生物代谢产物。尽管我们的研究提供了关于短链脂肪酸和TMAO在这种高血压编程模型中的证据，但其他肠道微生物代谢物的影响仍不清楚。尽管已经提出了一些高果糖诱导高血压编程的机制（如氧化应激和异常RAAS），但我们无法在当前研究中全面考察所有机制。丁酸和丙酸的积极效果是否归功于其他机制也值得进一步研究。最后，我们仅在成年后代中研究了肠道菌群谱。将后代与母体进行成对比较可能可以提供关于母体菌群如何影响后代的更多细节。综上所述，我们发现早期生命阶段的丁酸或丙酸补充可以重新编程母体高果糖饮食诱导的不良DNA编程过程，对后代产生保护作用。尽管丁酸和丙酸在保护后代免受高血压和增加循环短链脂肪酸浓度方面相似，但它们的保护机制有所不同。丁酸补充对TMAO代谢和NO通路具有更深远的影响，而丙酸治疗更具体地影响了肠道菌群组成和特定菌群。通过我们的研究，我们证明了母体营养的改变在成年后代中产生了编程和再编程效应。这项研究不仅支持了母体高果糖摄入可能对后代健康造成不利影响这一发现，还表明早期生命阶段的后生元补充可能作为预防高血压的潜在治疗策略。
