本研究通过单因素实验和响应面方法(RSM)对植物乳杆菌-R301的胞外多糖(EPS)产量进行了优化。优化后,EPS产量提高了0.85倍。通过普拉克特-伯曼设计和中心组合设计(CCD)确定的影响EPS产量的显著因素有MgSO4浓度、初始pH和接种量。在0.01% MgSO4,初始pH 7.4和6.4%接种量条件下,最大产量为97.85 mg/mL。此外,EPS表现出很强的抗氧化活性,通过清除DPPH,ABTS和羟基自由基来证明。在浓度分别为4 mg/mL,1 mg/mL和2 mg/mL时,清除率分别高达100%。此外,EPS还表现出氧化还原能力,当浓度增加时,其还原能力约为抗坏血酸的30%。这些结果表明,植物乳杆菌-R301的胞外多糖(EPS)具有不同的抗氧化机制。除了抗氧化活性外,EPS还具有出色的抗炎活性,能够抑制RAW 264.7细胞中脂多糖(LPS)诱导的炎症反应,从而降低一氧化氮(NO)的产生和促炎因子Il-6的表达。这些发现表明,植物乳杆-R301的EPS在食品工业中可以作为潜在的多功能食品添加剂使用。乳酸菌(LAB)作为一种益生菌广泛存在于自然界中。许多地区的人们食用含有乳酸菌的食物,并且已经证明乳酸菌在人体健康中起着重要作用。然而,在近年来,后生元制剂因其比益生菌更安全易于商业化的特点而被广泛研究。后生元制剂具有许多功能,如增强上皮屏障功能、有利于调节肠道菌群、免疫反应和系统代谢。此外,关于后生元制剂的研究主要集中在氨基酸、细胞上清液、胞外多糖(EPS)、脂肪酸、细菌素、酶、细菌细胞壁碎片和细菌裂解物等方面。EPS是一种具有多样化结构和物理化学特性的长链高分子多糖。这些多糖是由不同的微生物(如乳酸菌和芽孢杆菌)产生的次生代谢产物,分泌到细胞外空间。EPS具有许多优势:a.成本效益,一方面,生产EPS所需的培养基便宜;b.物种丰富,EPS的结构取决于微生物种类和培养基的组成。理论上,不同培养基中的菌株可以产生具有不同结构的EPS。这为筛选具有有益功能的EPS提供了定量依据。例如,附着在亲水链上的疏水基团使EPS具有两亲性,并能够作为天然乳化剂。将EPS添加到低脂美乃滋中可以改善产品的流变性和稳定性,某些EPS的乳化活性与黄原胶相当。此外,由于其出色的抗氧化能力,EPS可以作为食品加工中的潜在抗氧化剂。因此,EPS的这些特性在食品添加剂和功能性食品原料中具有巨大潜力。然而,在我们进一步开发EPS之前,存在两个问题。第一个问题是EPS的产量。EPS的产量受许多因素的影响,如微生物的种类、培养基成分(如碳源、氮源)以及不同微生物对于EPS产量所需的不同营养物。此外,培养条件(如温度、pH值)也会影响EPS的产量。而且,EPS产量的最佳条件并不总是与微生物的生长一致。有些EPS的合成仅在压力条件下由微生物完成。例如,副干酪乳杆菌的最佳生长温度为37°C,而适合EPS产量的温度为20°C。因此,对这些因素进行系统优化对于最大限度地提高EPS产量至关重要。另一个问题是EPS的生物活性。EPS的产量决定了其是否在工业上可行,而其功能则决定了研究和应用的方向。由于EPS结构的多样性,EPS的功能也非常广泛,如抗氧化、抗炎、乳化活性、抗菌、抗肿瘤、免疫调节和降低胆固醇活性。因此,揭示EPS的潜在生物活性对于进一步的研究和其在食品工业中的应用至关重要。本研究也同时解决了这两个问题。首先,优化了实验室中保存的植物乳杆菌-R301所产生的EPS的产量水平。使用单因素优化和响应面优化来优化培养基组成和培养条件,以获得最高的EPS产量,并研究不同营养物和培养条件对EPS产量的影响。另一部分是研究EPS的潜在生物活性,以便进行进一步的研究和应用。具体而言,本研究报道了EPS在体外的抗氧化活性,包括DPPH、ABTS、羟基自由基清除能力和还原能力。此外,使用LPS诱导的RAW 264.7炎症模型,研究了EPS的抗炎活性。提升EPS产量相关内容,小编在此进行信息折叠,我们重点将关注LPS的潜在生物活性内容。植物乳杆菌-R301菌株是从中国新疆省的传统中国泡菜样品中分离出来的。根据16S rRNA测序和形态特征对该菌株进行了鉴定。该菌株以含有50%甘油的MRS培养基保存在-80°C下。MRS培养基的成分包括葡萄糖(20 g/L)、蛋白胨(10 g/L)、酵母提取物(5 g/L)、牛肉浸膏(10 g/L)、无水醋酸钠(5 g/L)、K2HPO4(4 g/L)、三胺柠檬酸盐(2 g/L)、Tween-80(1mL/L)、MgSO4(0.58 g/L)和MnSO4(0.28 g/L)。EPS的纯化方法经过一些改进:为了分析准备EPS,首先将培养基在100℃下加热处理10分钟,以消除可能分解EPS的细菌和酶。然后,通过在13,523 RCF离心20分钟澄清培养液,将所得上清液与4℃的5%(w/v)三氯乙酸混合处理6小时,以去除任何剩余的蛋白质。通过再次进行13,523 RCF的离心20分钟,去除变性的蛋白质。将所得上清液与三倍体积的无水乙醇混合,放置于4℃过夜,使粗制EPS沉淀。最后,通过进行13,523 RCF离心20分钟来分离EPS。使用蒸馏水在4℃下进行24小时的透析,以去除培养基中的任何剩余成分和其他物质。每8小时更换透析水。透析后,将EPS溶液冷冻干燥,得到EPS粉末,并在-20℃下存储以进行后续研究。用葡萄糖作为标准物质,使用苯酚-硫酸法测定粗制EPS的产量。将1 mL样品与1 mL的5%苯酚溶液(w/v)混合,然后加入5 mL的98%硫酸。混合液在室温下搅拌孵育20分钟,然后在490 nm处测量吸光度。根据葡萄糖标准曲线得到的吸光度值计算粗制EPS的产量。采用改良方法测定DPPH自由基清除活性。简单地说,将不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL)的EPS与2 mL的0.2 mM DPPH溶液(溶解在绝对甲醇中)混合。混合物在室温下黑暗孵育30分钟。测量混合物的吸光度在517 nm处。空白组是用等体积的绝对甲醇替代DPPH制备的。对照组是用等体积的蒸馏水替代EPS制备的,抗坏血酸作为阳性对照。DPPH自由基清除活性通过以下公式计算:其中A是空白组的吸光度,A0是对照组的吸光度,A1是EPS组的吸光度。
测量ABTS自由基清除活性的方法经过一些修改。为了产生ABTS自由基,7 mM ABTS溶液和2.4mM 过硫酸钾溶液以相等体积混合,在室温下黑暗静置16小时。然后,将不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL)的EPS与1 mL的ABTS自由基溶液混合,在室温下黑暗孵育10分钟。测量混合溶液的吸光度在734 nm处。在空白组中,用等体积的蒸馏水替代ABTS,而在对照组中,用等体积的蒸馏水替代EPS。抗坏血酸作为阳性对照。ABTS自由基清除活性通过以下公式计算:其中A是空白组的吸光度,A0是对照组的吸光度,A1是EPS组的吸光度。
羟基自由基清除活性测定方法进行了一些修改。简单地说,将不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL)的EPS与1.5 mL的1.8 mM水杨酸、2mL的1.8 mM硫酸亚铁和1 mL的6 mM H2O2混合。混合物在37℃孵育30分钟后,通过以845 RCF离心5分钟收集上清液,其吸光度在510 nm处测量。空白组是用等体积的蒸馏水替代水杨酸制备的,而对照组是用等体积的蒸馏水替代EPS制备的。抗坏血酸作为阳性对照。羟基自由基清除活性通过以下公式计算:A是空白组的吸光度,A0是对照组的吸光度,A1是EPS组的吸光度。
还原力分析简单地说,将不同浓度的EPS(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL)与0.2 M磷酸盐缓冲液(pH = 6.6)和1%重铁氰化钾(w/v)混合,混合物在50℃孵育20分钟。在加入10%三氯乙酸(v/w)并以845 RCF离心10分钟后,上清液与蒸馏水和0.1% FeCl3(w/v)混合,然后在室温下孵育10分钟。在700 nm处测量吸光度,抗坏血酸作为阳性对照。RAW 264.7细胞系来源于美国细胞库。细胞在含有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良鹰氨酸培养基(DMEM)中,在5% CO2湿度控制的孵育箱中以37℃的温度维持。为了确保细胞的最佳生长条件,培养基每天更换一次。使用CCK-8试剂盒测量EPS对RAW 264.7细胞的毒性。将RAW264.7细胞以3.0×105个细胞/孔的密度接种在96孔板中,并孵育12小时。然后,细胞用不同浓度的EPS(0、20、40、60、80、100、500和1000 µg/mL)处理额外的24小时。之后,按照试剂盒说明书的要求,向每个孔中加入10 µL的CCK-8溶液,板在37℃黑暗中孵育2小时。测量反应溶液的吸光度在450 nm处,使用以下公式计算细胞存活率:AS是含有细胞、CCK-8和EPS的孔的吸光度,AB是含有培养基和CCK-8但没有细胞的孔的吸光度,AC是含有细胞和CCK-8但没有EPS的孔的吸光度。
2.4.3. 脂多糖(LPS)诱导的炎性巨噬细胞模型脂多糖(LPS)诱导的炎性巨噬细胞模型采用了改进方法。来自大肠杆菌0111:B4的LPS购自Sigma-Aldrich(美国圣路易斯)。将RAW 264.7细胞以3.0×105个细胞/孔的密度接种在96孔板中,并孵育12小时。然后,向每个孔中加入不同浓度的EPS并孵育额外的12小时。接下来,将LPS加入到每个孔中,最终浓度为1 µg/mL,并孵育另外24小时。为了创建LPS诱导的炎性巨噬细胞模型,按照上述相同的步骤进行。使用Griess试剂根据制造商的说明书测定一氧化氮(NO)含量。具体而言,依次向50 µL的培养基上清液中加入50 µL的Griess A和50 µL的GriessB,测量得到的反应混合物的吸光度在540 nm处。按照上述方法进行了改进的LPS诱导的炎性巨噬细胞模型构建;将RAW 264.7细胞以2.0×106个细胞/孔的密度接种到6孔板中,随后的步骤按照先前描述的方法进行。对于RNA提取,使用TRIzol试剂(Solarbio,北京,中国)提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop评估所有样品的RNA完整性。使用HiScript® III 1st Strand cDNA合成试剂盒(Vazyme,南京,江苏,中国)根据制造商的说明书合成所有cDNA。使用SYBR Green qPCR Master Mix(Bimake,休斯顿,德克萨斯,美国)进行qPCR。本研究使用的引物列在表3中。本研究采用两步扩增法:95℃预孵育30秒,95℃变性5秒,60℃延伸30秒,然后95℃变性5秒,60℃延伸60秒,95℃熔解1秒,共进行40个循环。通过将目标基因的表达与参考基因β-actin的表达进行比较,对基因表达进行归一化处理。结果以基因表达相对于对照样品的倍数增加报告。表3. RT-PCR实验使用的引物序列。
为了减小偏差,所有实验均进行了三次重复,细胞毒性分析和NO含量测量实验进行了六次重复。所有数据以每个实验中独立重复的均值±标准差(SD)的形式呈现。单因素实验中使用Dunnett的多重比较检验进行统计分析,优化研究、细胞毒性分析、NO含量测量和基因表达水平分析均采用一元方差分析(ANOVA)。使用Design-Expert 8.0.6软件对Plackett-Burman设计和CCD实验进行分析。p值<0.05被认为具有统计学显著性。EPS的DPPH自由基清除活性如图3A所示。在浓度范围为0至4 mg/mL时,抗坏血酸对自由基的清除能力明显高于EPS。例如,在0.5 mg/mL的浓度下,抗坏血酸的清除活性为94.44% ± 0.10%,而EPS的清除活性仅为29.27% ± 1.08%。此外,EPS的清除活性与其浓度范围(0-4 mg/mL)呈正相关。在4 mg/mL的浓度下,EPS的清除活性(97.69% ± 0.27%)高于抗坏血酸(94.74% ± 0.18%)。在4 mg/mL的浓度下,EPS和抗坏血酸的清除活性没有显著差异。
图3. EPS对以下物质的抗氧化活性:DPPH自由基(A),ABTS自由基(B),羟基自由基(C)和还原能力(D)。
EPS的ABTS自由基清除活性如图3B所示。在给定的浓度范围内,EPS和抗坏血酸的清除活性差异不大。只有在0.5 mg/mL时,EPS(96.26%± 1.68%)略低于抗坏血酸(100%)。EPS的羟基自由基清除活性如图3C所示。抗坏血酸的羟基自由基清除能力不如ABTS和DPPH自由基。达到100%清除能力所需的浓度为1 mg/mL,而ABTS为0.125mg/mL,DPPH为0.25 mg/mL。EPS在2 mg/mL下的清除能力为96.52%± 1.20%。在2 mg/mL浓度下,清除能力增加缓慢(2mg/mL → 8 mg/mL,96.52% ± 1.20% → 99.13% ± 0.49%)。EPS的还原能力如图3D所示。EPS的还原能力远低于抗坏血酸。抗坏血酸在0.25 mg/mL后缓慢增加,而EPS则在2 mg/mL后增加。当浓度增加时,EPS的还原能力约为抗坏血酸的30%。使用CCK-8试验确定EPS对RAW 264.7细胞的细胞毒性。在20-80 µg/mL的浓度范围内,EPS对RAW 264.7细胞的存活率没有显著影响(图4)。随着浓度的增加,RAW 264.7细胞的存活率逐渐下降。根据这个结果,我们选择了20、40和60 µg/mL的浓度进行抗炎实验。图4. EPS对RAW 264.7细胞存活率的影响。不同的小写字母表示显著差异(p < 0.05)。
3.3 EPS在LPS诱导的RAW 264.7细胞中的抗炎活性
3.3.1 EPS对NO产生的影响
NO产生的结果如图5A所示。与对照组相比(p < 0.05),LPS刺激显著提高了NO水平,而EPS处理组与LPS组相比明显抑制了NO水平(p < 0.05)。随着EPS浓度的增加,抑制能力增强,但这并不显著。
图5. EPS的抗炎作用:(A)NO产生,(B-E)EPS处理的RAW 264.7细胞中Inos (B)、Nf-κb (C)、Cox-2 (D)和Il-6(E)的mRNA表达。不同的小写字母表示显著差异(p <0.05)。
3.3.2 EPS对Inos、Nf-κb、Cox-2和Il-6转录水平的影响
上述基因的定量PCR结果如图5B-E所示。与NO产生试验的结果相反,在EPS处理组中,诱导型一氧化氮合酶(Inos)的表达水平与LPS组相比没有显著变化(图5B)。LPS处理显著增加了核因子κB(Nf-κb)的表达水平与对照组相比(p < 0.05),但EPS组与对照组之间没有差异(图5C)。与LPS组相比,EPS组的环氧化酶-2(Cox-2)的表达水平下降。然而,表达水平和EPS浓度在这三组之间呈正相关(图5D)。在LPS处理组和对照组之间,白细胞介素6(Il-6)的表达差异达到60倍。在EPS组中,与LPS组相比,Il-6的表达受到抑制,三个EPS组之间没有显著差异(图5E)。
讨论
正如我们讨论的,寻找具有良好功能活性的EPS是进一步研究的基础。在这项研究中,我们主要从两个方面研究了EPS的功能:抗氧化和抗炎作用。活性氧自由基(ROS)在包括细胞凋亡、细胞信号传导、基因调控和离子运输等多种细胞过程中具有重要功能。虽然活性氧自由基(ROS)具有重要的生理功能,但过多的ROS会对身体产生各种有害影响。这些包括损伤DNA、促进癌症发展和加速细胞退化,从而导致炎症、肺损伤和其他疾病。某些抗氧化剂,如叔丁基羟基苯(BHT)和叔丁基羟基甲苯(BHA),已被证明可以有效清除过多的自由基。然而,需要注意的是,这些抗氧化剂在身体上可能也具有有害作用。因此,有必要寻找新型的绿色和安全的抗氧化剂。在本研究中,我们评估了三种自由基:DPPH、ABTS和·OH(图3A-C)。在不同浓度下,EPS对这三种自由基的清除率可以达到100%。在一定程度上,植物乳杆菌-R301的EPS具有强大的抗氧化活性,因为大多数已知的EPS并没有如此强的清除活性。例如,L. plantarum KX041的EPS在浓度为8 mg/mL时,对这三种自由基的清除率可以达到约80%。在浓度为8 mg/mL时,Bacillus velezensis SN-1的EPS对这三种自由基的清除率约为60%。此外,L. plantarum R301的EPS还具有一定的还原能力(图3D),这表明EPS具有不同的抗氧化机制。然而,自由基清除活性只能用于初步评估。体外和体内实验并不总是产生相同的效果。例如,使用氧自由基吸收能力测定法鉴定的来源于卵透明质蛋白的抗氧化肽,在内皮细胞中被发现缺乏抗氧化活性。因此,未来还需要对EPS的抗氧化活性进行更全面的体内研究。
脂多糖(LPS)是最广泛研究的病原相关分子模式(PAMP)之一。当存在时,LPS可以结合并激活Toll样受体4(TLR-4),这是一种存在于特定免疫细胞表面的模式识别受体,如巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞。LPS与TLR-4的结合触发了一个信号通路,激活多个转录因子,并最终诱导炎症反应。该过程引发的免疫反应涉及前炎症细胞因子的合成,这些细胞因子在免疫系统对抗入侵病原体的能力中起着至关重要的作用。这种炎症反应包括前炎症细胞因子的产生,这在免疫系统清除入侵病原体的能力中起着关键作用。然而,过度的炎症可以扰乱免疫调节平衡,例如由过度活跃的炎症反应引发的细胞因子风暴,这可能进一步加重疾病甚至导致死亡。因此,控制炎症是预防疾病进一步恶化的有效方法。在这里,我们使用LPS诱导的巨噬细胞炎症模型评估了EPS的抗炎活性。我们发现,EPS可以减少前炎症细胞因子Il-6的产生(图5E)。此外,EPS处理减少了作为炎症的主要介质之一的Cox-2的表达(图5D)。这些结果表明,EPS具有抗炎作用,但具体机制尚不清楚。EPS具有几种潜在的抗炎机制,例如EPS能够抑制TLR4的表达。先前的研究显示,EPS可以减少在LPS诱导的巨噬细胞中产生的一种ROS,即一氧化氮(NO)(图5A)。这一结果很容易与EPS的优秀抗氧化活性联系起来。然而,EPS的抗氧化活性与抗炎活性是否有关以及它们如何相互作用,仍需要进一步研究。
结论:
在本研究中,EPS表现出强大的抗氧化活性,对DPPH、ABTS和羟基自由基具有较高的清除率。还发现EPS可以缓解LPS诱导的巨噬细胞炎症,表明EPS具有抗炎性能。因此,由乳酸菌产生的EPS具有抗炎和抗氧化作用,表明它有潜力作为食品工业中的食品添加剂或功能性食品成分使用。进一步的研究将集中在EPS的纯化、结构表征以及其抗炎和抗氧化活性的潜在机制的探索上。