近几十年来，乳酸菌（LAB）等益生菌的特性已经得到广泛研究。本研究调查了四种不同的LAB菌株，分别为Lactobacillus gasseri ATCC 33323（加氏乳酸杆菌）、Lacticaseibacillusrhamnosus GG ATCC 53103（鼠李糖乳杆菌）、Levilactobacillus brevisATCC 8287（短乳杆菌）和Lactiplantibacillus plantarum ATCC14917（植物乳杆菌），以确定它们在人体肠道中的存活能力。这些菌株的耐酸性、对模拟胃肠条件的抵抗力、抗生素抗性以及编码生成菌素的基因的鉴定分别进行了评估。经过3小时后，这四种菌株均表现出高强度对模拟胃液的抵抗力，存活细胞数的下降量均小于1个log周期。其中，L. plantarum在人体肠道中的存活量最高，达到7.09 log CFU/mL。对于L. rhamnosus和L. brevis，这些值分别是6.97和6.52。经过12小时后，L.gasseri的存活细胞数下降了3.96个log周期。此外，还鉴定了这些LAB菌株中编码生成细菌素的基因。Pediocin PA（广谱抗菌肽——片球菌素）基因在Lactiplantibacillus plantarum ATCC 14917、Lacticaseibacillusrhamnosus GG ATCC 53103和Lactobacillus gasseri ATCC33323中被识别出。PlnEF（细菌素结构基因）基因在Lactiplantibacillusplantarum ATCC 14917和Lacticaseibacillus rhamnosus GGATCC 53103中被检测到。然而，Brevicin 174A（细菌素结构基因）和PlnA基因未在任何菌株中检测到。此外，还评估了LAB代谢产物的可能抗氧化能力，并使用自由基DDPH•（a，a-二苯基-β-苦啶肼）测试了它们的自由基清除活性，还评估了它们对过氧自由基引起的DNA断裂的抑制作用。所有菌株均表现出抗氧化活性；然而，L. brevis（94.47%）和L.gasseri（91.29%）在210分钟时表现出最佳的抗氧化活性。本研究提供了一种综合性的方法，研究了这些LAB的作用以及它们在食品工业中的应用。在过去几十年中，益生菌一直是一个热门的学科。根据联合国粮食和农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）的定义，益生菌被定义为“当作为食物的一部分，在充足的量下摄入时能够对宿主产生健康益处的活性微生物”。这样，它们具有调节胃肠道微生物平衡的能力。它们有几个功能机制，包括加强上皮屏障、通过拮抗作用抑制病原体、与宿主结合和相互作用以及产生抗微生物素。乳制品和/或发酵食品，是供人类益生菌的良好来源。乳酸菌（LAB）大多用于发酵过程，因为它们通过碳水化合物转化提供乳酸，并且还有助于发酵食品的发展。此外，它们通过产生对如李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌等病原体有作用的抗微生物剂来帮助食品产品的安全。最常见的自然或在这些食品产品中使用的益生菌属于Lactobacillus（乳酸菌属）和Bifidobacterium（双歧杆菌属）属，被分类为安全（GRAS）。它们主要是糖解性、革兰氏阳性、杆状并驻留于大肠。它们具有耐氧化和厌氧性质，因此可以在非氧化环境中发现，但也可以支持好氧条件。另一方面，一些LAB菌株在消化道中是至关重要的，它们产生抗菌代谢产物如细菌素，并防止病原微生物和感染微生物生长。因此，提出了一套标准来证明益生菌活性，包括能够提供理想的代谢产物（如细菌素）并对酸和胆盐具有耐受性，以及在肠道中具有附着能力且不对抗生素产生抗性。多种LAB，尤其是Lactobacillus种，可产生细菌素，这些抗菌肽与抗生素不同，其作用针对密切相关的微生物。它们基本上可以分为一级兰替生物类（如双歧杆菌素和乳杆菌素）、二级非兰替生物类（如艮岳乳杆菌素PA1和白葡萄酒菌菌素A）和三级细菌毒素（如帕塔托杆菌素A和肠毒素A）。多种物质的抗氧化活性已经得到广泛研究，科学家们的兴趣已经转向天然抗氧化剂，因为它们具有治疗和促进健康的能力。活性氧（ROS）的水平对于免疫反应抵抗入侵微生物非常关键，但是，ROS过度产生的情况下存在氧化应激风险，导致蛋白质和脂质氧化以及DNA损伤。LAB已经被广泛研究其抗氧化活性，使用了不同的实验方法来研究其抗氧化效果，并显示出了自由基清除能力、抑制脂质过氧化能力和金属螯合能力，以及各种抗氧化酶活性。Bifidobacterium和Lactobacillus属的成员已被报道可以降低2,2-二苯基-1-苯基丙酮肼（DPPH）和2,2'-联氨基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基的水平。因此，探究某株菌株的抗氧化活性的适当方法是评估DPPH和ABTS自由基清除活性以及硝酸盐的抑制作用。基于基因组测序，LAB细菌素基因可被准确地识别。细菌素编码基因位于染色体上的操作子簇（如PlantaricinST31）、质粒上（如Plantaricin423）或转座子上（如Nisin A）。多项研究已经从不同菌株中鉴定出细菌素，包括L. plantarum（C11，WCFS1，NC8，J23和J51）中的Plantaricin，L. plantarum WHE 92中的Pediocin PA-1 / AcH，L. sake 674中的Sakacin674，L. sake LTH673中的SakacinP以及L. bavaricus MI401中的Bavaricin A。由于缺乏数据，本研究在于对某些LAB（Lactobacillus gasseri ATCC 33323，Lacticaseibacillus rhamnosus GG ATCC 53103，Levilactobacillusbrevis ATCC 8287和Lactiplantibacillus plantarum ATCC14917）的益生菌特性进行了表征。这些特性包括它们对酸的耐受性、对模拟胃肠道条件的抵抗力、编码乳酸菌素产生的基因的鉴定，以及它们的抗氧化活性，即根据它们自由基清除活性和对過氧自由基诱导的DNA断裂的抑制作用。为了培养所研究的物种Lactobacillus gasseri ATCC 33323，Lacticaseibacil-lusrhamnosus GG ATCC 53103，Levilactobacillus brevis ATCC8287和Lactiplantibacillus plantarum ATCC 14917（LAB），使用了MRS（De ManRogosa Sharp）培养基。培养在厌氧条件下进行，温度为37℃，时间为48小时，含有20%（v/v）无菌甘油的MRS培养基用于保存-80℃的菌株。提取过程步骤具体如下：按照上述描述进行培养和孵育，然后用13000×g离心培养基7分钟。为了获得无菌细胞上清液（CFSs），上清液使用0.22微米孔径的滤膜过滤，无菌未接种的MRS培养基用作阴性对照。在50毫升圆锥管中加入10毫升乙酸乙酯、1克氯化钠、4克硫酸钠和10毫升CFSs。将其在4000×g下离心10分钟。收集5毫升有机相，加入100微升二甲基亚砜（DMSO），并在旋转蒸发器中干燥，然后在样品经过滤（0.22微米）前，用90%水和10%甲醇重组。清除a, a-二苯基-β-苦肟(DPPH)自由基，DDPH•是一种紫色稳定自由基，通过与抗氧化剂反应，可以被还原为2,2-二苯基-1-苯基丙酮肼（淡黄色）。在甲醇中制备了6×10-5 M的DDPH•溶液。将1.0 mL CFSs加入2.5 mL乙醇DPPH自由基溶液(Asample)中。将样品在暗处充分混合后，在室温下孵育30分钟。三重复测量上清液的吸光度，同时也测量了无CFSs的DDPH自由基(Acontrol)。总抗氧化活性以µg/mL没食子酸表示，并以需要使DDPH吸收减少50%的抗氧化剂量（IC50）来表示结果。为了计算自由基清除活性，使用以下方程：自由基清除活性（%）= [(A control -A sample)/A control] × 100%其中，Asample=样品吸收度；Acontrol=对照吸收度。DL-对羟基苯乳酸酸(OH-PLA)、1,2-二羟基苯、苯甲酸、水杨酸、香草酸、阿魏酸和4-羟基肉桂酸的标准溶液用于评估抗氧化活性。评估LAB CFSs对DNA断裂的有效性，用2,2'-偶氮双(2-氨丙烷)二盐酸盐(AAPH)诱导DNA链断裂，并进行琼脂糖电泳检测。使用含有Tris碱、醋酸和EDTA混合物的缓冲液(TAE缓冲液，pH8.5，浓度为25 µg/mL)悬浮DNA。将4µL超螺旋pBR322 DNA，4µL30 mM AAPH和2µL在10 mM PBS(磷酸盐缓冲液)稀释后的样品混合并在37℃下孵育30分钟，同时还制备了空白（无样品）和对照（无AAPH或样品）。在每个混合物中加入1µL加载染料（凝胶加载染料紫色(6×)，不含SDS，(新英格兰生物实验室, Ipswich, MA, USA)）然后样品被用15µL溴化乙锭的0.8%琼脂糖凝胶载入。在100 V下进行电泳约70分钟，在紫外线下观察DNA带。使用UV照明MiniBIS Pro装置（DNR Bio-Imaging Systems Ltd.，Modi'in-Maccabim-Re'ut，Israel）测量DNA带的强度。抗氧化活性表示为剪切DNA中保留下来的DNA百分比，归一化到对照。将10 mL PBS（pH 2.5）与LAB物种（108 CFU/mL）混合，在37°C下孵育1、2、3小时。然后在MRS琼脂培养基上测定活菌数。通过在37°C下厌氧培养的MRS琼脂培养基中枚举三次实验中每个培养物的生物量（CFU/mL）[38]。使用以下公式获得存活率（%）。存活率（%）=酸处理后生物量（C1）/初始时刻生物量（C0）× 100准备模拟胃肠液。将1 g胃蛋白酶（猪胃黏膜中的胃蛋白酶，Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国）、1.5 g胃黏液（猪胃II型黏液，Sigma-Aldrich）、8.7 g NaCl和5 g胆汁盐（猪胆汁提取物，Sigma-Aldrich）溶解在1 L水中。经过3小时，将1 mL的悬浮液接种到9 mL模拟肠液（pH 8.0，在37°C下孵育）。测试在pH8（HCl 2M）和2.5%（w/v）干猪胆汁盐存在下，Lacticaseibacillus rhamnosus GGATCC 53103、Lactiplantibacillus plantarum ATCC14917、Lactobacillus gasseri ATCC 14917和Levilactobacillusbrevis ATCC 8287的活力（log cfu/mL）在孵育3、6、9和12小时后。样品在37°C下厌氧孵育，并在各自的终点上回收以进行计数。将LAB在MRS培养基上进行无氧培养48小时，37°C，然后在14000×g下离心15分钟。遵循供应商的建议程序，使用自动提取器和核酸提取试剂盒（ZYBIO Corporation，中国重庆）立即从细胞沉淀中提取DNA。采用美国Biotek Winooski, Winooski, VT, VT的Epoch分光光度计，通过计算OD260/OD280比值[34]来评估分离DNA的质量和数量。使用PCR方法鉴定编码产生细菌素的基因。对于plnA、plnEF和pediocinPA-1基因扩增，使用以下条件：95°C 5 min，然后30个循环，在94°C的解旋阶段30 s，1 min的退火阶段，具体温度列于表1中，1 min的延伸，以及72°C的10 min的最终延伸。进行Brevicin 174A基因PCR的步骤如下：96°C 5 min的1个循环，58°C 15 s，72°C 30 s，然后29个循环：96°C 1 min，58°C15 s，72°C 30 s，并在72°C下延伸7 min。表1列出了本研究中应用的特定引物。PCR产物在含有乙溴铵染料（0.5 g/mL，Sigma，日本神奈川）的2.0%（w/v）琼脂糖凝胶上检测。分子量基准是使用100 bp的梯形电泳图像来判定的（Invitrogen，英国Paisley）。MiniBIS Pro设备（DNR Bio-Imaging Systems Ltd.，以色列Neve Yamin）用于在120 V下运行电泳图像约1小时后，在UV照射下进行记录。
表1：本研究中使用的引物及其扩增细节。
使用95%的显著性水平（STATISTICA® 7.0，StatSoft Inc.，美国俄克拉荷马城）进行方差分析（ANOVA）分析所测试益生菌的抗氧化活性。使用Duncan的多重范围检验“p = 0.05”计算显著性差异。对于指数模型（二相衰减）的统计拟合，使用非线性回归（XLSTAT2023.1.1）。为了发挥益生菌的益处，益生菌应该在摄入后保持活力，并能够抵抗胃肠道系统的恶劣环境。有几项研究报告基于对胆汁盐和低pH环境的抵抗力来选择益生菌菌株的某些标准。我们选择了四种乳酸菌物种，对食品病原微生物具有抗微生物作用。然而，虽然这种抗微生物作用是其潜在益生菌的必要条件，但不能将它们直接确定为益生菌菌株。因此，进一步评估这些菌株的一些特性，以进一步阐明它们作为益生菌菌株的用途。抗模拟胃肠液
胃的pH值范围为1.5至4.5，摄入约需3小时。为了让益生菌微生物能够在通过胃部时存活下来，抗酸能力是一种至关重要的特征。本研究使用酸性条件（pH 2.5，3小时）进行初始筛选。所有四个测试菌株均表现出良好的模拟胃液抵抗力，如表2所示。3小时后，所有的菌株存活率超过90％，并保持相对恒定。所有菌株均仍然活力，可见细胞浓度下降不超过1个对数周期。因此，选择了这四个菌株进行进一步研究。潜在的益生菌必须能够通过消化系统并足够地在结肠内繁殖。如表3所示，三个菌种（Lactiplantibacillusplantarum ATCC 14917、Lacticaseibacillus rhamnosus GGATCC 53103和Levilactobacillus brevis ATCC 8287）在暴露于模拟肠道液后表现出良好的存活能力。因此，选择了这三个菌种进行进一步研究。其中，Lactiplantibacillus plantarum ATCC 14917在计数方面表现出最高的存活率为7.09 log CFU/mL。对于Lacticaseibacillusrhamnosus GG ATCC 53103和Levilactobacillus brevis ATCC8287，这些值分别为6.97和6.52。在12小时后，Lactobacillus gasseri ATCC 33323的可行计数下降了3.96个对数周期。细胞群体维持在超过4 log CFU/mL。与胃液相比，Lactobacillus gasseri对肠液敏感。
表3. LAB物种在模拟肠液中的存活率。
氮桥含有DPPH自由基的一个原子，DPPH是一种稳定的自由基，带有一个未配对的价电子。流行的DPPH抗氧化剂测定基于清除DPPH自由基。氧化剂和抗氧化剂作用不平衡会引起氧化应激。在我们的研究中，使用DPPH自由基清除技术评估LAB的CFS的体外抗氧化活性。在不同的时间（0分钟，30分钟，60分钟，90分钟，120分钟，150分钟，180分钟，210分钟），测量了四个LAB浓度的不同CFS的吸光度。所有LAB都具有DDPH自由基清除活性。比较所有乳酸菌，L. brevis（94.47％）和L.gasseri（91.29％）在210分钟时获得了最佳的抗氧化活性。在210分钟时，L. rhamnosus和L.plantarum的DPPH清除率分别为83.41％和77.53％。在之前的研究中，我们已经确定并量化了Lactobacillusgasseri ATCC 33323，Lacticaseibacillus rhamnosus GG ATCC53103，Levilactobacillus brevis ATCC8287和Lactiplantibacillus plantarum ATCC 14917株产生的代谢物。最初，我们研究了每种乳酸菌的CFS经过5天孵育后的抗氧化活性，结果显示所有物种均具有抗氧化活性（图1）。然后我们分别测试了每个乳酸菌中识别出的代谢物，并在孵育5天后记录了数量。在Lactobacillus gasseri ATCC 33323中检测到的代谢物包括DL-p-羟基苯乳酸（OH-PLA）（6.0 ppm），1,2-二羟基苯（3.73 ppm）和苯甲酸（2.31 ppm）。在Lactiplantibacillus plantarum ATCC 14917中识别出了OH-PLA（150.3 ppm），水杨酸（1.0 ppm），香草酸（2.2 ppm），香豆酸（4.8 ppm），苯甲酸（3.2 ppm）和4-羟基肉桂酸（1.0 ppm）。在Lacticaseibacillusrhamnosus GG ATCC 53103中发现了OH-PLA（123.2ppm）和香豆酸（1.5ppm），Levilactobacillus brevis ATCC 8287中发现了OH-PLA（80.2ppm）和香草酸（1.5ppm）等物质。同时，也研究了每个乳酸菌CFS中检测和量化的标准的抗氧化活性。3种标准（（OH-PLA），1,2-二羟基苯和苯甲酸）的DPPH清除率为74.82％（图2）。另一方面，6种标准混合物，OH-PLA，水杨酸，香草酸，香豆酸，苯甲酸和4-羟基肉桂酸，显示出32.82％的清除率。2种标准物质混合物OH-PLA和香豆酸的清除率为38.35％。2种标准混合物OH-PLA和香草酸的清除率为36.94％。根据结果显示，CFS中还存在其他抗氧化代谢物，可以增加清除率。
图1：实验室抗氧化活性(孵育5 d后)。(实验数据与统计拟合指数方程-两相衰减= pr1 × exp(−pr2×X1) + pr3 × exp(−pr4×X1) + pr5)。
图2：实验室检测抗氧化活性
超螺旋质粒DNA链抑制效应测定了样品对过氧化自由基剪切DNA链的保护质量。图3展示了DNA断裂抑制的结果。DNA断裂的抑制大部分符合预期的模式。活性最高的是Lactiplantibacillus plantarum ATCC 14917的CFS，它具有97.38％的抑制率。其次是Levilactobacillus brevis ATCC 8287，Lacticaseibacillus rhamnosus GG ATCC 53103和Lactobacillusgasseri ATCC 33323的CFS，其抑制率分别为94.15％，89.21％和88.29％。对照组(仅DNA)显示约15％的剪切DNA，而空白组(仅DNA和AAPH)则未显示抑制。控制组(DNA only)显示约15％的缺口DNA，而空白(仅DNA和AAPH)则未显示抑制。
图3：乳酸菌CFS存在下的过氧化物自由基诱导的DNA断裂凝胶电泳。1号线：Levilactobacillusbrevis ATCC 8287的CFS，2号线：Lacticaseibacillus rhamnosus GG ATCC 53103的CFS，3号线：Lactobacillus gasseri ATCC 33323的CFS，4号线：Lactiplantibacillusplantarum ATCC 14917的CFS，5号线：对照组(DNA only)，6号线：空白组(DNAand AAPH only)。
4、细菌素结构基因的检测
为了检测编码细菌素的基因的存在，使用四组特异引物进行PCR反应。分别使用Pediocin PA-1和plnEF的特异引物，检测到616和1220 bp的产物。然而，使用plnA和brevicin174A的特异引物未扩增出DNA片段(见表4)。根据图4，Pediocin PA基因存在于Lactiplantibacillusplantarum ATCC 14917，Lacticaseibacillus rhamnosus GGATCC 53103和Lactobacillus gasseri ATCC 33323中。此外，检测到Lactiplantibacillus plantarum ATCC 14917和Lacticaseibacillusrhamnosus GG ATCC 53103中plnEF基因的存在(见图5)。
表4：乳酸菌中细菌素基因的PCR扩增
图4.LAB中Pediocin PA（1220 bp）序列的检测。
第1行：Levilactobacillus brevis ATCC 8287；
第2行：Lactiplantibacillus plantarum ATCC 14917；
第3行：Lacticaseibacillus rhamnosus GG ATCC 53103；
第4行：Lactobacillus gasseri ATCC 33323；
图5. LAB中plnEF（616 bp）序列的检测。
第1行：Levilactobacillus brevis ATCC 8287；第2行：Lactiplantibacillus plantarum ATCC 14917；第3行：Lacticaseibacillus rhamnosus GG ATCC 53103；第4行：Lactobacillus gasseri ATCC 33323；综上所述，我们的数据表明乳酸菌是天然抗氧化剂的优秀来源，具有对食源性病原体的抗菌活性。此外，这些菌株未来可以用作发酵食品的起始菌种。在本研究中，我们使用一系列体外分析方法来评估四种乳酸菌的益生性能。除了Lactobacillus gasseri ATCC 33323（加氏乳杆菌）在肠液中孵育12小时后呈现出最低的微生物群落动态外，所有菌株均表现出最佳的益生性。
